Sigrid Milles

Forschung

Intrinsisch ungeordnete Proteine in der Clathrin-vermittelten Endozytose

Die Endozytose ist für den Eintritt von Molekülen, z.B. von Nährstoffen, Signalmolekülen und ihren Rezeptoren, aber auch Krankheitserregern, in die eukaryontische Zelle verantwortlich. Dieser Mechanismus ist daher sehr wichtig und stützt sich auf das kleine Protein Clathrin (Clathrin-abhängige Endozytose), welches das Gerüst bildet, das die Membran formt und schließlich zur Aufnahme eines umhüllten Vesikels führt. Für diesen hochgradig regulierten Aufnahmeprozess sind jedoch noch viele andere Proteine notwendig, unter anderem Adaptorproteine, die lange intrinsisch ungeordnete Regionen (IDR) enthalten, d.h. Regionen ohne stabile dreidimensionale Struktur. Diese Regionen sind mit kleinen Sequenzabschnitten, so genannten linearen Motiven, durchsetzt, die mit anderen Proteinen aus dem Prozess der Endozytose interagieren: anderen Adaptoren zum Beispiel oder Clathrin. Obwohl diese Interaktionen für die Endozytose von entscheidender Bedeutung sind, sind sie aufgrund der Flexibilität und Dynamik der IDR, in die sie eingebettet sind, nicht sehr gut verstanden.

[Translate to Deutsch:] scheme endocytosis — © Sigrid Milles

Unser Ziel ist es, integrative Ansätze zu entwickeln, bei denen Einzelmolekül-Fluoreszenz und NMR-Spektroskopie eingesetzt werden, um diese intrinsisch ungeordneten Adaptorproteine zu untersuchen und den molekularen Mechanismus zu verstehen, durch den ihre linearen Motive den Prozess der Endozytose regulieren. Das Verständnis der Funktionsweise dieser Motive ist nicht nur für die Endozytose wichtig, sondern auch für viele andere biologische Prozesse, die ebenfalls lineare Motive für ihre Interaktionen nutzen.

Integration von Einzelmolekülfluoreszenz und NMR Spektroskopie

Kernmagnetische Resonanz (NMR) und die Einzelmolekülfluoreszenz-Spektroskopie gehören zu den Techniken, die sich am besten für die Untersuchung der von Natur aus dynamischen intrinsisch ungeordneten Proteine (IDP) eignen.

NMR-Parameter, wie z.B. chemische Verschiebungen oder residuale Dipolar-Kopplungen, geben Aufschluss über lokale strukturelle Neigungen der IDR/IDP mit atomarer Auflösung. Einzelmolekül-Fluoreszenz andererseits, insbesondere der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET/smFRET), erfasst intra- und inter-molekulare Distanzen, die für die NMR unerreichbar sind und die oft wesentliche Informationen beitragen, um das molekulare Verhalten der IDR/IDP zu erklären. Gleichzeitig wohnen der NMR- wie auch der Fluoreszenzspektroskopie Parameter inne, die durch molekulare Bewegungen auf unterschiedlichen Zeitskalen beeinflusst werden. Für beide Techniken bestehen bereits experimentelle Ansätze, um die Analyse der Proteindynamik von Pikosekunden bis Millisekunden und darüber hinaus zu ermöglichen. Die Kombination der beiden Techniken erlaubt es allerdings, über sehr unterschiedliche Distanzen hinweg und mit hoher Auflösung, schnelle sowie langsamere Prozesse zu analysieren. Diese sind wichtig z.B. um die intrinsisch ungeordneten Polypeptidketten zu beschreiben, deren Konformationen sich sehr schnell ineinander umwandeln, oder zur Charakterisierung von vorübergehend besiedelten Sekundärstrukturen oder Bewegungen von ganzen Protein-Domänen, die sich auf einer deutlich langsameren Zeitskala abspielen.

Wir arbeiten mit einem selbstgebauten Einzelmolekül-Fluoreszenzspektrometer, das wir kontinuierlich weiter entwickeln. Außerdem entwickeln wir qualitative und quantitative Ansätze zur Integration der Parameter beider Techniken in ein gemeinsames dynamisches Strukturmodell.